Búsqueda del gen responsable del Síndrome de Opitz C

¿Cómo se inició este proyecto?

El proyecto se inició en 2011 tras el contacto entre Carles (presidente de la Asociación de Pacientes de Opitz C y padre Marta, una paciente) y nuestro grupo de Genética Molecular Humana de la Universitat de Barcelona (liderado por los Drs. Grinberg y Balcells). La historia de Carles y su familia y lo devastador del Síndrome de Opitz C nos conmovió y decidimos asumir el reto de buscar el gen o genes responsables de este síndrome.

(Para saber más sobre el síndrome de Opitz C y el de Bohring-Opitz pincha aquí)

En este inicio se estableció una estrecha colaboración con el Dr. Giovanni Neri, que había estado llevando a cabo un estudio sobre esta enfermedad y facilitó la mayoría de las muestras de los pacientes y sus familiares, y el propio Dr. John M. Opitz, quien ha revisado el diagnostico de los pacientes.

Esta colaboración y el contacto directo de Carles con las familias nos permito reunir un grupo de 12 pacientes y sus familiares, mayoritariamente diagnosticados como OCS, si bien uno de los pacientes fue diagnosticado como BOS y un pequeño grupo quedó con “diagnostico tentativo”.

Pedigrees
En verde, los pacientes claramente diagnosticados como Opitz C, en rojo, el paciente diagnosticado como Bohring-Opitz y en naranja, aquellos con un diagnostico poco claro

¿Que se ha hecho ya?

Entre los años 2007 y 2009, el grupo liderado por el Dr. Giovanni Neri (Universita Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Italia) realizó un estudio de MicroArray –CGH. En este estudio participaron 7 pacientes diagnosticados como Opitz C. En uno de los pacientes se caracterizó una gran deleción, lo que llevó al equipo investigador a excluirlo del grupo de pacientes Opitz C. En el resto de pacientes no se encontró ninguna modificación genómica significativa. El MicroArray-CGH permite detectar grandes reordenaciones genómicas (deleciones, translocaciones e inserciones), del mismo modo que haría un cariotipo, pero con un nivel de resolución mucho mayor. Pero es incapaz de detectar cambios sutiles: mutaciones puntuales o inserciones y deleciones pequeñas.

Gupo de Genética Molecular Humana (UB)
Gupo de Genética Molecular Humana (UB)

Como hemos dicho, en el año 2011, Carles, acudió a nuestro grupo de Genética Molecular Humana de la Universidad de Barcelona en busca de ayuda para que la investigación en este síndrome continuase su curso ya que nuestro grupo tiene una gran experiencia y tradición en el estudio de enfermedades raras. En este año se estableció una colaboración efectiva con el equipo del Dr. Neri en Roma y con el mismo Dr. Opitz en Utha, se recogieron las muestras de los 7 pacientes participantes en el estudio del Dr. Neri y sus familias y desde entonces se han reclutado 6 pacientes más (incluyendo una pareja de hermanos afectados).

Financiados principalmente por los fondos de la Asociación y de las propias familias y la colaboración del CIBERER y el CNAG y la entusiasta participación del BIER, hemos realizado la secuenciación masiva (ver más abajo) de 4 grupos familiares, incluyendo una pareja de hermanos, y de dos pacientes individuales, con su consiguiente análisis bioinformático.

En el Departamento de Genética hemos filtrado miles de cambios y analizado más de 200 posibles mutaciones mediante secuenciación tradicional. Estos análisis nos han permitido confirmar el diagnóstico de Bohring-Opitz en lugar de Opitz C, ofreciendo a su familia un diagnóstico molecular preciso, lo que abre la vía al diagnóstico prenatal. También se ha encontrado la causa genética de la patología en la pareja de hermanos, también descartándolos como Opitz C y definiendo mejor su fisiopatología. Afortunadamente existe un tratamiento posible con resultados relativamente esperanzadores para los individuos con mutaciones en el mismo gen que ellos, lo que brinda a estos chicos nuevas oportunidades de mejorar su calidad de vida, y ofrece a la familia la posibilidad de un diagnóstico prenatal en caso de desearlo.

También hemos encontrado una mutación nueva en un gen poco conocido en una de las pacientes Opitz C españolas. Desgraciadamente no hemos encontrado ningún cambio en el mismo gen en el resto de los pacientes, lo que nos obliga a emprender costosos ensayos funcionales para dilucidar si este cambio es realmente la causa de la enfermedad en la paciente (ver más abajo).

¿Y que falta por hacer?

Siguen quedando muchos cambios por validar y muchos análisis por hacer. Queremos poder realizar el estudio del exoma (ver más bajo) de restantes familias y abordar los ensayos funcionales necesarios, en especial para la mutación ya encontrada en una paciente Española.

Poder continuar dando esperanzas a estas familias depende de la colaboración de todos. Por eso rogamos tu participación en este proyecto. Tu apoyo es fundamental para estas familias.

 Puedes ayudar a la investigación en la búsqueda del gen responsable del Síndrome de Opitz C con una donación a la asociación de pacientes (asopitzc.org) o bien uniéndote al grupo de teaming por 1€ al mes. IMGP5221Foto: roseruf (c)

¿Quieres saber más?

¿Cómo se aborda este estudio?

Hasta la fecha, la técnica más utilizada en la búsqueda de nuevos genes ha sido el análisis de ligamiento o Linkage, en que se analiza la herencia compartida ente familiares afectos y no afectos. Pero el éxito de este análisis está muy limitado a la disponibilidad de grandes familias con más de un miembro afectado, lo que no es siempre posible. En muchos casos, a la hora de abordar el estudio de una enfermedad, contamos con familias pequeñas (padre, madre, el paciente y a veces un hermano, afecto o no). Otra limitación de la técnica del análisis de ligamiento es que obtener buenos resultados es muy dependiente de conocer el patrón de herencia de la patología, cosa que en este caso ya hemos determinado que sigue siendo desconocido.

Tradicionalmente otra aproximación con buenos resultados ha sido la secuenciación de genes candidatos. Esta estrategia consiste en analizar la secuencia nucleotídica de los pacientes para un número muy limitado de genes, elegidos en base a una hipótesis clara y plausible de implicación de dichos genes en el desarrollo de la patología. Dado el gran desconocimiento que hay sobre el Síndrome de OpitzC y su afectación tan variada, esta estrategia no es razonable, más allá de analizar los genes que se han asociado ya con esta patología o similares (ASXL1, CD96 y recientemente ASXL3 (Bainbridge, Hu et al. 2013)).

En general, estas técnicas se han usado de forma combinada ya que los ensayos de ligamiento no suelen ser suficientemente resolutivos, “señalando” regiones muy grandes, con 10-30 genes en ellas, como regiones posiblemente implicadas en la enfermedad. Una vez se selecciona una región, se analiza qué genes contiene y se secuencian aquellos que sean “mejores candidatos” por su función (Brunham and Hayden 2013).

Pero como hemos dicho, en el caso que nos ocupa no disponemos ni de granes familias que nos permitan abordar un ensayo de ligamiento eficaz ni de un patrón bioquímico o clínico claro que nos pueda sugerir unos pocos candidatos (fuera de los tres ya mencionados). De ahí que estas técnicas hayan resultado inútiles para encontrar la base genética del Síndrome de Opitz C.

En los últimos 10 años han aparecido nuevas técnicas, conocidas como secuenciación de alto rendimiento o de siguiente generación (NGS por el inglés, Next Generation Sequencing) que han permitido abordar estos proyectos que, de otro modo, era prácticamente imposible realizar.

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¿Qué son las NGS (o secuenciación de alto rendimiento)?

Mientras que la secuenciación tradicional permite visualizar pequeños fragmentos del genoma (alrededor de 1000pb), la secuenciación masiva permite secuenciar la práctica totalidad del genoma de un individuo (unas 3000Mb). Es decir, tienen cerca de un millón de veces más rendimiento. El coste por par de bases (bp) de cada una es muy distinto. Mientras que la secuenciación tradicional tiene un coste de unos 3€ por fragmento, un genoma entero cuesta entre 1000 y 3000€. Así que a nivel de precio por pb es mucho más competitiva la secuenciación del genoma, pero a nivel general, un genoma es caro. Además es importante analizar tanto al paciente como a los padres y son varios grupos de varios pacientes, lo que supone un número relativamente elevado de muestras y dispara los costes de este tipo de proyectos.

La realidad es que la mayoría de mutaciones causantes de enfermedades severas como la que nos ocupa se encuentra en una pequeña fracción del genoma, lo que conocemos como exoma. El exoma es el conjunto de los exones, aquellas regiones de cada gen que contienen la información estrictamente necesaria para realizar la función de dicho gen (en la mayoría de los casos, formar una proteína). Hay unos 180.000 exones que constituyen el 1% de la totalidad del genoma.

Actualmente existen diversas técnicas de “captura” (o enriquecimiento) que nos permiten secuenciar exclusivamente estas regiones de interés en un individuo dado, lo que se conoce como Secuenciación de Exomas (ES, por Exome Sequencing). Esta técnica cubre la mayor parte de la región informativa y reduce los costes sensiblemente (secuenciar un exoma cuesta entre 600 y 800€) (Bamshad, Ng et al. 2011).

Esta técnica está siendo ampliamente usada en genética humana con buenos resultados. De hecho, fue mediante esta técnica que se encontraron las mutaciones en el gen ASXL1 causantes de BOS que hemos mencionado anteriormente (Hoischen, van Bon et al. 2011) y ha permitido encontrar genes implicados en otras enfermedades raras (Bamshad, Ng et al. 2011).

Esta técnica presenta una enorme ventaja frente a la secuenciación de genes candidatos o al linkage: no necesitamos tener un diagnóstico clínico claro y esta técnica es útil incluso cuando hay más de un gen implicado en la aparición de la enfermedad. Nos permite realizar un análisis personalizado, familia a familia, incluyendo aquellos casos con diagnósticos dudosos. Dado lo poco que se sabe del Síndrome de Opitz y su gran heterogeneidad clínica, la secuenciación masiva es la única herramienta existente con buenas perspectivas de éxito.

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Foto: roseruf (c)

Y una vez secuenciado, ¿qué?

Dada la cantidad de nucleótidos secuenciados es lógico que un porcentaje de las mutaciones observadas sean errores producidos durante el proceso de secuenciación. La mayoría de métodos de secuenciación masiva tienen ya porcentajes de error inferiores al 1º/ºº (Mestan, Ilkhanoff et al. 2011). Aún así, al secuenciar unas 30 Mb (es decir, 30 millones de pares de bases, un exoma) esperamos cerca de 30.000 errores por cada muestra analizada. Así, los datos generados por la secuenciación masiva deben ser primero filtrados y depurados (DePristo, Banks et al. 2011):

  • En primer lugar, por parámetros de calidad de la lectura, lo que reduce drásticamente el número de errores.
  • Disponemos además de bases de datos públicas (1000Genomes, EVS, entre otras) que recogen las mutaciones comunes en la población general. Estas bases de datos nos permiten eliminar aquellos cambios encontrados en los pacientes y presentes en personas sanas que, por lo tanto, no serán causantes de la enfermedad. Así, eliminaremos cerca del 90% de los cambios restantes en cada paciente.
  • Finalmente, debemos filtrar en función del patrón de herencia en que creemos que se transmite la enfermedad. Como ya hemos dicho antes, desconocemos la herencia del síndrome de Opitz C, así que será necesario realizar tres tipos de filtrado distintos: autosómico dominante, autosómico recesivo e incluso recesivo ligado al X en el caso de los varones. De ahí la importancia de incluir a los padres en el proyecto y analizarlos también mediante secuenciación masiva.

Todos estos pasos de filtrados son llevados a cabo bioinformáticamente mediante el uso de algoritmos específicos adaptados a las necesidades de cada proyecto. En particular, nuestro grupo cuenta con la plataforma de Bioinformática de las enfermedades Raras (BIER), en Valencia.

Tras estos filtrado obtenemos un conjunto de cerca de mil posibles cambios que deben ser filtrados de forma más pormenorizada y priorizados (Gilissen, Hoischen et al. 2012). Tras esta selección, los cambios deben ser validados.

Cada uno de estos posibles cambios será analizado en detalle mediante secuenciación tradicional. Cerca del 90% de ellos son falsos positivos (no existía tal cambio) o con falsa herencia (el patrón de herencia no era el que se suponía). Así, poco a poco, se van seleccionando aquellos cambios que podrían ser responsables del desarrollo de la patología en cada paciente.

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Y una vez validado un cambio, ¿será responsable del Síndrome?

Todas las personas tenemos nuestras particularidades. A nivel genético también. Se estima que cada persona lleva una nueva mutación, no heredada de sus padres (Lynch 2010), conocidas como mutaciones de novo, pero la mayoría de estos cambios son inocuos. Existen indicios que nos ayudan a deducir si un cambio es responsable de una enfermedad o no. La función del gen, la posición del cambio dentro del gen, el tipo de cambio… y sobretodo que varios pacientes presenten cambios en el mismo gen (Brunham and Hayden 2013). Pero en algunas ocasiones es necesario empelar técnicas directas para elucidar si los cambios encontrados son responsables o no de la enfermedad. Se conocen como ensayos funcionales y en ellos se evalúa la función del gen “sano” y mutado “in vitro” en modelos celulares e incluso, si es necesario, “in vivo” en modelos animales.

Por el contrario, si aparecen mutaciones en varios pacientes en un mismo gen, tal como ocurre en el caso de las mutaciones de ASXL1 en el Síndrome de Bohring-Opitz, podemos tener una base razonable para determinar que el gen es el responsable de esta enfermedad (de ahí la necesidad de secuenciar cuantos más pacientes, mejor).

FOTO: roseruf (c)

 Referencias:

Antley, R. M., D. S. Hwang, et al. (1981). “Further delineation of the C (trigonocephaly) syndrome.” Am J Med Genet 9(2): 147-163.

Bainbridge, M. N., H. Hu, et al. (2013). “De novo truncating mutations in ASXL3 are associated with a novel clinical phenotype with similarities to Bohring-Opitz syndrome.” Genome Med 5(2): 11.

Bamshad, M. J., S. B. Ng, et al. (2011). “Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery.” Nat Rev Genet 12(11): 745-755.

Brunham, L. R. and M. R. Hayden (2013). “Hunting human disease genes: lessons from the past, challenges for the future.” Hum Genet 132(6): 603-617.

Darlow, J. M., L. McKay, et al. (2013). “On the origins of renal cell carcinoma, vesicoureteric reflux and C (Opitz trigonocephaly) syndrome: A complex puzzle revealed by the sequencing of an inherited t(2;3) translocation.” European Journal of Human Genetics 21(Suppl. 2. (Abstract)): 145.

DePristo, M. A., E. Banks, et al. (2011). “A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.” Nat Genet 43(5): 491-498.

Gilissen, C., A. Hoischen, et al. (2012). “Disease gene identification strategies for exome sequencing.” Eur J Hum Genet 20(5): 490-497.

Hoischen, A., B. W. van Bon, et al. (2011). “De novo nonsense mutations in ASXL1 cause Bohring-Opitz syndrome.” Nat Genet 43(8): 729-731.

Kaname, T., K. Yanagi, et al. (2007). “Mutations in CD96, a member of the immunoglobulin superfamily, cause a form of the C (Opitz trigonocephaly) syndrome.” Am J Hum Genet 81(4): 835-841.

Lalatta, F., D. Clerici Bagozzi, et al. (1990). “”C” trigonocephaly syndrome: clinical variability and possibility of surgical treatment.” Am J Med Genet 37(4): 451-456.

Lynch, M. (2010). “Rate, molecular spectrum, and consequences of human mutation.” Proc Natl Acad Sci U S A 107(3): 961-968.

Mestan, K. K., L. Ilkhanoff, et al. (2011). “Genomic sequencing in clinical trials.” J Transl Med 9: 222.

Opitz J. M., Johnson R. C., et al. (1969). “The C syndrome of multiple congenital anomalies.” Birth Defects Orig. Art. Ser. 2: 161-166.

Opitz, J. M., A. R. Putnam, et al. (2006). “Mortality and pathological findings in C (Opitz trigonocephaly) syndrome.” Fetal Pediatr Pathol 25(4): 211-231.

Sargent, C., J. Burn, et al. (1985). “Trigonocephaly and the Opitz C syndrome.” J Med Genet 22(1): 39-45.

Travan, L., V. Pecile, et al. (2011). “Opitz trigonocephaly syndrome presenting with sudden unexplained death in the operating room: a case report.” J Med Case Rep 5: 222.

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